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如何使用液相色谱仪?

如何使用液相色谱仪?

【概要描述】液相色谱仪是分析工作者最常用的一个仪器。深圳德谱仪器从事仪器行业多年,如何使用液相色谱仪,德谱深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时,便是到了游刃有余、驾轻就熟的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能,如能庖丁解牛般使用,便可将此测定做到事半功倍、轻松自如。

如何使用液相色谱仪?

【概要描述】液相色谱仪是分析工作者最常用的一个仪器。深圳德谱仪器从事仪器行业多年,如何使用液相色谱仪,德谱深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时,便是到了游刃有余、驾轻就熟的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能,如能庖丁解牛般使用,便可将此测定做到事半功倍、轻松自如。

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液相色谱仪是分析工作者最常用的一个仪器。深圳德谱仪器从事仪器行业多年,如何使用液相色谱仪,深感何时能将液相做到有“打游戏”感觉时,便是到了游刃有余、驾轻就熟的境界。现今的液相软件均已具备了强大的数据处理功能,如能庖丁解牛般使用,便可将此测定做到事半功倍、轻松自如。

一、溶质如何在水相中溶解

对于需要溶解在水相中的无机盐类、表面活性剂等固溶体,推荐加热,不推荐摇晃、超声等。 因此,这种溶解方式,溶质可能处于“临界胶束浓度”,然后遇特殊情况(如有机溶剂、温度急剧下降、  ETC。); 一旦析出,会损坏仪器和色谱柱,在泵头处析出“盐白粉”现象。

二、流动相的制备和使用


1. 恒定洗脱

必须在水相和有机相混合后,抽滤(使用混合滤膜),用管道(如A管)泵入仪器。 这就是使用原则。 请勿使用两条管路(一根纯水相,一根纯有机相)泵入仪器,以节省有机相,便于探索色谱条件,即使配备脱气机。 因此,这种情况很可能导致水相中出现少量盐类和表面活性剂的沉淀。

剩余流动相可继续完全使用,密封放置阴凉处; 下次测试时可与新配制的流动相混合,然后抽滤。 不用担心发霉、无机盐析出、挥发、比例不准确等,这些都是妄想症的表现。 实践是检验真理的唯一标准! 实践一下~


2.梯度洗脱

最科学的流动相制备方法是:A相为高比例水相-低比例有机相,B相为低比例水相-高比例有机相(英国药典几乎是 相同的); 其次是:A相是高比例的水相——低比例的有机相,B相是纯有机相; 最不科学的是:A相是纯水相,B相是纯有机相,如果现有的质量标准用这个建议换成第二种或第一种方法,否则基线漂移严重,很难 进行稳定的杂质检测。

梯度洗脱完成后,建议5分钟后恢复初始状态,平衡5分钟后开始下一次测量。 这 10 分钟的稳定非常关键。 不要在短时间内恢复到初始状态,否则会对仪器和色谱柱造成很大的损坏。


三、色谱柱的安装


标准 SOP 应该是:

取A管放入流动相瓶→拧下泵头→流速从0ml/min逐渐增加到10ml/min,10秒观察尾液是否呈瀑布状流出→拧紧泵 头部 → 流动相从安装好的色谱柱一端喷出,观察是否为抛物线 5 秒 → 流速逐渐降低至 1.0ml/min → 安装好色谱柱,等待 20 秒,流动相 从色谱柱的另一端呈弹簧状流出,然后安装另一端→握住两端的螺帽并拧紧。


上述安装顺序如下:

残留在仪器内的气泡和清洗液会逐步排出,安装后气泡极难混入。 我用梯度洗脱实验了一周,第一次进样和最后一次进样的主成分保留时间相差在6秒以内。

 

四、 试验后色谱柱的清洗

 

1.最为常用的C8柱、C18柱

1.1 流动相仅为乙腈-水或甲醇-水时

继续冲洗30分钟,流速1.0ml/min,柱温保持试验时温度,即可。

1.2 水相中有无机盐、表面活性剂或三乙胺、高氯酸等物质时

先采用纯水(或含有2%甲醇),冲洗A管路(试验采用哪个管路,就要从头到尾冲洗该管路),时间30分钟(如流动相中有表面活性剂,适当增加时间),流速1.0ml/min,柱温可较试验温度高出5~10℃;随后更换成20%甲醇再冲洗30分钟,流速1.0ml/min,柱温箱加热装置关闭。结束后取下色谱柱放置阴凉处。

很多同仁其后采用高比例的甲醇冲洗,实属画蛇添足,导致残余的有机相中水相遇到高比例的甲醇后析出少量盐和表面活性剂,从而在泵头上、色谱柱中析出,也导致了色谱柱寿命大为缩短。本人曾使用过一根约2000元的色谱柱,正着用了四年、倒着用了两年(倒着用测非有关物质)。

2. 其他类型色谱柱

查询获取如何科学合理地使用与清洗保存该类型色谱柱的方法,切勿盲动,否则导致色谱柱性能急剧下降。

五、 试验顺序


工作流程应如下进行:

(1) 0~2小时 配制流动相、对照品和供试品溶液等,切勿催促昨日试验同事。

(2) 2~3小时 采用A管路注入流动相(B、C、D管路一般不用,除非梯度洗脱才用到B管路),平衡1小时。如流动相中有表面活性剂,建议前一晚小流速过夜,第二天上班后将流速增至1.0ml/min,平衡1小时后即可开始做试验。

(3) 3~5小时 测定空白溶剂,一定要做到基线不漂移后方可开始测定。所谓“不漂移”,通常系指以1.0%自身对照溶液主成分峰高约20%高度来设定的视野范围观察所得,切不可设定得过小,使得杂质峰显得很突兀、基线抖动得很厉害,弄得人很担心。

(4) 5~8小时 配制完所有样品,预试了对照溶液和供试品溶液,设定好自动进样程序,程序最后一针设定为小流速过夜,紫外灯关闭。切勿设定为切换至B管路洗脱,此举得不偿失。

(5) 9~24小时 放心回家,让仪器自动进样,除非不稳定的样品(配制一份测定一针)。充分利用下班后的16小时,做到从容不迫、镇定自若。如单位还无自动进样装置,建议向领导申请购买,因一台自动媲美三台手动。

(6) 第二天0~0.5小时 检查并计算昨晚试验结果,如发现不良记录,将流速增至1.0ml/min,平衡30分钟后,测定重新配制的该份样品即可(同时回校对照一针)。无需全部重新测定,不要过度谨小慎微。

(7) 第二天0.5~2.0小时 如上冲洗色谱柱,交给其后试验同事。

六、 液相软件的使用

现今几大主流品牌的硬件性能已相差无几,主要还是软件的设计是否能使操作者得心应手、随心所欲。

建议掌握各软件的批处理、编辑样品处理模板等功能,做到一劳永逸,让软件充分为工作所用。“磨刀不误砍柴工”:本人曾用20分钟完成500个溶出度样品数据处理,做出溶出曲线图。体会一下~

七、 其他

1.如需使用正相系统,一定要单独采用一台仪器(如二手的、较为破旧的、淘汰的等),切勿采用异丙醇转换,此举对仪器损伤极大,等于“自杀”。

2. 正相所使用的流动相(如正己烷、环己烷等),无需抽滤,混匀超声后即可使用,“大道至简”。

3. 柱温箱必须配制。如欲经济,可购买国产柱温箱。

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